Animali geneticamente modificati e ricerca: possiamo realmente fidarci?

“Geneticamente modificato” (abbreviato GM) è un termine generico per indicare diversi tipi di manipolazione operata sul genoma degli organismi animali (ma anche vegetali, batteri, ecc.) da parte dell’uomo attraverso tecniche di ingegneria genetica.

Un animale transgenico è un animale geneticamente modificato a cui è stato inserito DNA esogeno (proveniente da un’altra specie) all’interno del genoma.

Un animale Knockout (KO) è un animale in cui è soppressa l’espressione di un determinato gene. Knockin è un animale nel cui genoma è stato inserito uno specifico gene esogeno (ad es. modificato) sostituendolo a quello originario. In accordo con le statistiche (Home office statistics 2005) tra il 1990 ed il 2005, si è verificato un progressivo aumento dell’utilizzo degli animali GM in UK, principalmente topi. Diversi consorzi internazionali sono coinvolti nel generare topi GM, con l’obiettivo collettivo di isolare e caratterizzare almeno una linea di topi GM per ogni gene nel genoma murino.

Principali vantaggi dei modelli murini GM

◾L’utilizzo dei modelli murini GM è giustificato da diversi vantaggi:

◾I topi sono relativamente semplici da far riprodurre e da mantenere in cattività in modo economico

◾Hanno vita breve: non si pongono problemi per il mantenimento e le cure dell’animale a lungo termine, inoltre in poco tempo si possono ottenere diverse generazioni quindi si possono ad es. osservare come vengono trasmesse le mutazioni nelle generazioni successive

◾Sono particolarmente adatti all’analisi ed alla manipolazione genetica e sono docili

◾Esiste un’enorme quantità di informazioni sulla biologia, fisiologia e genetica dei topi utilizzati in laboratorio

◾La comparazione dei genomi rivela che uomo e topo hanno dei genomi di grandezza comparabile e condividono un’alta percentuale di geni (Mouse Genome Sequencing Consortium 2002, International Human Genome Sequencing Consortium 2001).

◾Processi cellulari, biologici e fisiologici condivisi

Limiti

  • La creazione di un solo ceppo GM può richiedere l’utilizzo di un numero molto grande di animali, poiché a) i metodi utilizzati per indurre mutagenesi non sono del tutto efficienti b) c’è una scarsa trasmissione delle modifiche genetiche alla prole c) le alterazioni genetiche possono interferire con la fecondità e la sopravvivenza.
  • L’utilizzo dei modelli murini GM potrebbe fuorviare i ricercatori, specie nello studio delle malattie poligeniche e complesse.
  • Si tratta comunque di situazioni artificiali, per cui non si tiene conto del CONTESTO in cui il gene oggetto di studio è inserito. Da quanto emerge dai più recenti studi sulla genomica, il contesto in cui è inserito un gene ha una notevole importanza per la sua regolazione. Ne viene che ignorare tale concetto non è più accettabile.

Riportiamo soltanto alcuni esempi di come la modifica indotta artificialmente di uno o più geni all’interno del genoma di un animale possa portare a conseguenze del tutto impreviste.

Fibrosi cistica

I modelli murini di fibrosi cistica, ottenuti attraverso la tecnica del gene targeting e delezione del gene per il CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, un canale ionico) presentano quasi esclusivamente i sintomi gastrointestinali della malattia e non quelli polmonari come nell’uomo (Snowaert 1992). Ciò potrebbe essere dovuto alla co-espressione, nel polmone del topo ma non nell’uomo, di un trasportatore alternativo, che compensa la mancanza del CFTR (Rochelle 2000). Inoltre nel polmone di topo le cellule secernenti muco sono presenti in misura minore rispetto al polmone umano (Ameen et al. 2000). I modelli murini di fibrosi cistica non presentano nemmeno disfunzioni pancreatiche, cirrosi epatica e diminuzione della fertilità, tutti segni tipici della patologia nell’uomo (Mall et al. 2004).

Anemia falciforme

Nel corso degli anni sono stati creati diversi modelli murini (transgenici) di anemia falciforme. Questa forma di anemia è causata nell’uomo dalla mutazione del gene responsabile della sintesi della catena beta dell’emoglobina. Tale alterazione si traduce in una sostituzione di un amminoacido nella catena beta della globina, con conseguente formazione della cosiddetta emoglobina S (HbS), che in determinate situazioni conferisce all’eritrocita la tipica forma di falce. Ciò determina il quadro clinico di anemia emolitica cronica. I modelli murini di anemia falciforme tuttavia ricapitolano soltanto parzialmente ed in modo limitato la patologia dell’uomo: in alcuni casi non presentano una sufficiente proporzione di eritrociti anormali, in altri sono presenti gli eritrociti falciformi in rilevante quantità ma ciò non si traduce necessariamente in un quadro di anemia emolitica (Greaves et al. 1990, Trudel et al. 1999). Anche i migliori modelli murini di anemia falciforme riproducono soltanto alcune delle caratteristiche della malattia umana (Paszty et al. 1997, Manci et al. 2006)

Diabete di tipo 1

Sono stati creati dei modelli murini knockout di diabete insulino dipendente principalmente per cercare di comprendere il ruolo del sistema immunitario e della genetica nella patogenesi di questa malattia. I modelli murini potrebbero essere degli ottimi ausili per la comprensione dei meccanismi molecolari di base che sottostanno all’autoimmunità (Melanitou et al. 2005). Tuttavia i rischi che potrebbero derivare da un’eccessiva focalizzazione sui modelli murini, in particolare per quanto riguarda il sistema immunitario, sono stati evidenziati da diversi autori e già riassunti nell’articolo “modelli murini e sistema immunitario”. Senza contare che le differenze tra il diabete nell’uomo e la patologia provocata nei modelli murini sono degne di nota, ad esempio nei topi l’incidenza della malattia è maggiore per il sesso femminile, cosa che non avviene nell’uomo (Whitacre 2001).

Diabete di tipo 2

Sono stati creati diversi modelli murini GM per lo studio di specifiche caratteristiche del diabete di tipo 2. I topi knock out non si sono rivelati utili per decifrare i meccanismi di tale patologia. Topi doppi knock out per recettore dell’insulina ed il canale che ne regola la secrezione non hanno manifestato sintomi di diabete come invece era stato previsto in base all’omologia di funzione tra proteine umane e murine (Kanezaki2004). Inoltre, mentre è noto che nell’uomo una mutazione nel gene che codifica per uno specifico recettore coinvolto nella regolazione della secrezione dell’insulina (SUR1) causa precocemente una persistente iperinsulinemia ed ipoglicemia, i topi knock out per lo stesso gene presentano una glicemia normale. Ciò è probabilmente dovuto alla presenza, nel topo e non nell’uomo, di un secondo meccanismo di regolazione per la secrezione dell’insulina (Shiota 2002).

Alcuni segni del diabete di tipo 2 umano, come obesità, resistenza all’insulina ed iperinsulinemia sono presenti nei topi che esprimono in modo ectopico1 la proteina “aguti”, una proteina coinvolta nella pigmentazione della pelliccia e nella regolazione del peso corporeo. Tali modelli hanno semplicemente confermato che la proteina agouti ha diverse funzioni nel topo, molte delle quali possono ricordare superficialmente le funzioni delle proteine umane. Non sono tuttavia stati utili a chiarire i meccanismi patogenetici del diabete di tipo 2 e dell’obesità nell’uomo.

Il “diabete” dei ceppi murini GM sopra descritti, a differenza di quanto accade nell’uomo, si manifesta molto precocemente e l’iperglicemia sembra essere presente soltanto nel maschio, ciò che non è il caso dell’uomo (Kelbig et al. 1995).

Difetti visivi

Esistono diverse importanti differenze nel sistema visivo del topo e dell’uomo e derivano soprattutto dal fatto che il topo è un animale prevalentemente notturno. Alcune delle maggiori differenze riguardano la densità dei coni (necessari alla visione dei colori), l’assenza di una fovea (per l’acuità visiva) nella retina del topo, che però possiede un’alta densità di bastoncelli (necessari alla visione notturna). La presenza di 2 (e non 3 come avviene nell’uomo) pigmenti nel topo ed i diversi picchi di assorbimento degli stessi nell’uomo e nel topo contribuiscono a rendere scarsamente rilevante il modello murino per le malattie visive. I topi mutanti per il gene della rodopsina (un pigmeto visivo) non presentano retinopatia severa come invece accade nell’uomo (Jacobs et al. 1991).

Distrofia muscolare

Nell’uomo la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una patologia recessiva legata alla mutazione di un gene (gene per la distrofina) sul cromosoma X. Nell’uomo la DMD si manifesta precocemente (di solito entro i 5 anni d’età) con una rapida degenerazione muscolare. Essendo che si tratta di un disordine legato al cromosoma X, è più frequente nei maschi. Nel topo il gene omologo per la distrofina non si trova sul cromosoma X. La sua alterazione da’ origine invece ad una malattia autosomica recessiva le cui caratteristiche differiscono dalla DMD dell’uomo: si manifesta nel topo entro 2 settimane dalla nascita ed è generalmente letale a 6 mesi dall’esordio (Cooper 1989). Considerando la differenza nella durata della vita tra le 2 specie, i segni di malattia nel topo si presentano più precocemente. I danni istologici riscontrati nelle cellule muscolari del topo sono di grado molto maggiore rispetto a quelli presenti nell’uomo, inoltre, mentre la DMD umana ha un’ origine miogena, quella del topo sembra essere invece di origine neurogena. Un secondo modello murino di distrofia muscolare mima la natura recessiva X-linked della DMD umana, tuttavia vi sono notevoli differenze nella patogenesi delle 2 malattie: a differenza di quanto accade nell’uomo, i giovani topi recuperano, dopo un’iniziale fase di necrosi, la funzionalità muscolare, rimanendo a lungo esenti dai sintomi della malattia (Daingain e Vrbova 1984). Aggiungendo anche le differenze anatomiche nel posizionamento dei gruppi muscolari nell’uomo e nel topo, si capisce quanto possa essere limitato l’utilizzo di tali modelli anche nella determinazione dei dettagli meccanici legati alla malattia, a loro volta collegati allo sviluppo di nuovi farmaci (Elbrink et al. 1987).

Il gene Hrpt del topo

Una delle prime mutazioni generate attraverso la tecnica del gene targeting nelle cellule staminali embrionali riguarda questo gene. Nell’uomo l’inattivazione del gene omologo è alla base di una grave patologia (sindrome di Lesch-Nyhan). Nel topo l’inattivazione di tale gene non causa alcuno dei sintomi di tale malattia (Kuehn et al. 1987, Finger et al. 1988), verosimilmente poiché nel topo esiste una ridondanza funzionale, un altro gene che potrebbe supplire all’inattivazione di Hrpt (Wu e Melton 1993). Tuttavia anche il doppio knockout per entrambi i geni continua a non presentare alcun evidente fenotipo patologico (Engle et al. 1996, Wu et al. 1994).

Gli esempi descritti sopra si riferiscono ovviamente a quei casi in cui le differenze (fenotipi) sono evidenti e per le quali a volte se ne è anche identificata almeno parzialmente la natura. Che dire di tutto ciò che non conosciamo? Stiamo studiando la patologia umana nel topo o piuttosto stiamo studiando una patologia del tutto diversa che assomiglia soltanto in modo superficiale a quella umana ricapitolandone parzialmente i segni clinici e/o i riscontri laboratoristici?

I topi geneticamente modificati senza fenotipi evidenti o con fenotipi del tutto inattesi sono casi molto frequenti, tenendo anche conto del fatto che c’è la tendenza a non pubblicare i risultati negativi, un’analisi dei dati in letteratura potrebbe sottostimare l’entità del problema (Barbaric et al. 2007).

Un altro grande limite dei modelli animali GM è legato al fatto che raramente le patologie dipendono unicamente dall’alterazione di un singolo gene ma sono quasi sempre multifattoriali. Ad esempio Stingl et al. (2009) in una revisione riguardante 20 anni di ricerca sull’ipertensione su modelli animali GM:

In the 1990’s, genetically modified animals (GMO) were considered to be the key to solving this problem of high complexity (hypertension). However, until now, although a few approaches have shown that old, well-known drugs have a positive effect (decrease of blood pressure) on such animal models of hypertension, no approach has appeared in the literature of this area of research which might indicate a direct connection between GMO and a therapeutic strategy to treat or prevent this type of hypertension in humans. Instead, criticism of the GMO approach has accumulated in the last years, arguing that it is misleading as this disease does not have a monogenic cause and so complementary regulatory mechanisms could prevent the true identification of the function of the modified genes. Furthermore, the technology is best developed in mice, whose physiology of blood pressure is different from that of humans.

E ancora

The extrapolation from animal experiments to humans must be considered with much more caution. Today, it can no longer be assumed that every gene that plays a role in hypertension in an animal is also relevant in humans.

Anche Bhogal e Combes (2006) mettono in discussione la rilevanza dei modelli murini GM per le patologie umane:

It should be recognized that the generation of GA mice has often confused, rather than improved, our understanding of the genetic basis of human diseases. The large numbers of only partly-relevant models available for many diseases have complicated the meaningful extrapolation of the information they provide to human medicine. There is an urgent need to re-evaluate GA mice as models of human disease, to take into account the availability of alternative models based on studies on lower organisms, normal and diseased human cells, and the increasingly availability of other sources of human information of direct relevance. Some studies in GA mice have been less informative than the corresponding investigations with less-complex organisms and cell culture systems. This is particularly true for mouse models developed by using forward genetics, where an undefined number of mutations may have contributed to an overall phenotype which resembles a human disorder, but which may share few, if any, of the underlying biochemical or genetic causes of the respective human disorders. The relevance of many transgenic mouse models can be questioned on the basis that, even if a species gene homologue has the same function and expression patterns and levels in humans and mice, all the remaining components of the biochemical pathway must be equally represented in the surrogate animal, if relevant mouse models of human diseases are to be created within a laboratory setting.

Gli stessi autori spiegano come a volte degli organismi relativamente meno complessi quali gli invertebrati, possano dare più informazioni rispetto a quanto possano fare dei modelli più complessi, come ad es. i topi o altri mammiferi, la cui complessità è comunque differente da quella umana:

In view of the limitations of GM mice in the modeling of human diseases in ways that have resulted in many effective cures, and because some of the genes involved have been conserved in evolution, the possibility of undertaking at least preliminary studies in organisms such as C. elegans (a nematode) and D. melanogaster (an insect) deserves more serious attention. Indeed, the higher gene density, often higher natural mutation rate, and relative ease with which the genomes of such organisms can be manipulated and studied, emphasizes the importance of a thorough investigation into how studies in less sentient organisms can be used to curb the increasing animal welfare burden inherent in using GA mice. Of course, these invertebrate organisms do not display the complexity of the human body. However, the above attributes, together with the much lower gene duplication rates in these lower organisms, means that functional abnormalities due to gene mutants or knockouts of the target gene will have a reduced likelihood of being rescued by other genes. This simplifies the process of assigning gene function, which, in mice, is complicated by the prevalence of gene duplication and gene compensation.

 

Note

 

  1. Per espressione ectopica di un gene si intende l’espressione di un gene con una localizzazione differente da quella naturale.

 

Bibliografia

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